In der ersten Runde haben die besten sieben Teams der Abschlusstabelle 2008/2009 der Frauen-Bundesliga Freilos: Somit greifen der Deutsche Meister 1. FFC Turbine Potsdam, Vizemeister FC Bayern München, Pokal-Titelverteidiger FCR 2001 Duisburg, der 1. FFC Frankfurt, die SG Essen-Schönebeck, der Hamburger SV und SC Freiburg erst in der zweiten Pokalrunde ins Geschehen ein.
Die 50 Klubs, die in der ersten Runde im Lostopf sind, setzen sich aus den fünf verbliebenen Erstligisten der Abschlusstabelle 2008/2009, den Mannschaften der 2. Frauen-Bundesliga des abgelaufenen Spieljahres, den beiden Aufsteigern in die 2. Frauen-Bundesliga und den Pokalsiegern der 21 Landesverbände zusammen. Es werden zwei regionale Gruppen für die erste Hauptrunde gebildet.
Die erste Runde des DFB-Pokals der Frauen wird am 13. September ausgetragen. Das eigenständige Finale der Frauen findet am 15. Mai 2010 erstmals in der Kölner Arena statt.
Folgende Vereine nehmen in der Saison 2009/2010 am DFB-Pokal der Frauen teil:
1. Bundesliga: SC 07 Bad Neuenahr, TSV Crailsheim, FCR 2001 Duisburg, SG Essen-Schönebeck, 1. FFC Frankfurt, SC Freiburg, Hamburger SV, Herforder SV, FF USV Jena, FC Bayern München, 1. FFC Turbine Potsdam, VfL Wolfsburg
2. Bundesliga: Tennis Borussia Berlin, 1. FC Union Berlin, SV Dirmingen, SV Victoria Gersten, FSV Gütersloh 2009, ASV Hagsfeld, SV Blau-Weiß Hohen Neuendorf, FSV Jägersburg, Holstein Kiel, 1. FC Lok Leipzig, Bayer 04 Leverkusen, FV Löchgau, SG Lütgendortmund, Mellendorfer TV, FFC Wacker München, FFC Oldesloe, 1. FC Saarbrücken, SC Sand, VfL Sindelfingen, SG Wattenscheid 09
Aufsteiger in die 2. Bundesliga: Werder Bremen, TuS Wörrstadt, Magdeburger FFC, 1. FC Köln (Die zweite Mannschaft des FC Bayern München, Aufsteiger aus der Regionalliga Süd, ist nicht teilnahmeberechtigt)
Landespokalsieger: 1899 Hoffenheim, SV 67 Weinberg, 1. FC Lübars, SV Rot-Weiß Flatow, ATS Buntentor, SC Eilbeck 1913, TSV Jahn Calden, 1. FC Neubrandenburg 04, SV RW Merl, Borussia Mönchengladbach, TSG Burg Gretesch, TuS Ahrbach, SV Bardenbach, Leipziger FC 07, Hallescher FC, FC Angeln 02, Hegauer FV, 1. FFC 08 Niederkirchen, 1. FFV Erfurt, DJK Eintracht Coesfeld, TSV Ludwigsburg
