Demnach werden Werder Bremen als Aufsteiger aus der Regionalliga Nord und der Magdeburger FFC (Meister Regionalliga Nordost) in der Nordstaffel antreten, hinzu kommt der Herforder SV als Absteiger aus der Bundesliga. Zudem wird zukünftig die SG Wattenscheid 09 in der Nordstaffel spielen, die noch in der vergangenen Saison im Süden startete.
Die Südstaffel werden ab sofort der Bundesliga-Absteiger TSV Crailsheim sowie die Aufsteiger FC Bayern München II (Regionalliga Süd), TuS Wörrstadt (Regionalliga Südwest) und der 1. FC Köln (Regionalliga West) bereichern.
Die Saison in den 2. Bundesligen beginnt am 20. September 2009.
Die beiden Staffeln im Überblick:
Nord-Staffel:
Hamburger SV II
Werder Bremen (Aufsteiger Nord)
Holstein Kiel
FFC Oldesloe
SV Victoria Gersten
SV BW Hohen Neuendorf
1. FFC Turbine Potsdam II
Magdeburger FFC (Aufsteiger Nordost)
FSV Gütersloh 2009
Herforder SV (Absteiger FBL)
SG Wattenscheid 09
1. FC Lokomotive Leipzig
Süd-Staffel:
TSV Crailsheim (Absteiger FBL)
FFC Wacker München
SC Sand
FC Bayern München II (Aufsteiger Süd)
ASV Hagsfeld
VfL Sindelfingen
1. FFC Frankfurt II
TuS Wörrstadt (Aufsteiger Südwest)
FV Löchgau
1. FC Köln (Aufsteiger West / ehemals FFC Brauweiler-Pulheim)
Bayer 04 Leverkusen
FCR 2001 Duisburg II